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技術支持

大腸桿菌質粒DNA的提取步驟

更新時間:2023-11-16   點擊次數:54次

質粒DNA的提取是從事基因工程工作中的一項基本實驗技術,但提取方法有很多種,以下介紹一種最chang用的方法:

堿裂解法:此方法適用于小量質粒DNA的提取,提取的質粒DNA可直接用于酶切、PCR擴增、銀染序列分析。方法如下:

1、接1%含質粒的大腸桿菌細胞于2ml LB培養基。

2、37℃振蕩培養過夜。

3、取1.5ml菌體于Ep管,以4000rpm離心3min,棄上清液。

4、加0.lml溶液I(1%葡萄糖,50mM/L EDTA pH8.0,25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。

5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH,1% SDS),輕輕翻轉混勻,置于冰浴5 min 。

6、加入0.15m1預冷溶液III(5 mol/L KAc,pH4.8),輕輕翻轉混勻,置于冰浴5 min 。

7、以10,000rpm離心20min,取上清液于另一新Ep管

8、加入等體積的異戊醇,混勻后于0℃靜置10min。

9、再以10,000rpm離心20min,棄上清。

10、用70%乙醇0.5ml洗滌一次,抽干所有液體。

11、待沉淀干燥后,溶于0.05mlTE緩沖液中。

煮沸法

1、將1.5ml培養液倒入eppendorf管中,4℃下12000g離心30秒。

2、棄上清,將管倒置于衛生紙上幾分鐘,使液體流盡。

3、將菌體沉淀懸浮于120ml STET溶液中,渦旋混勻。

4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml),渦旋振蕩3秒鐘。

5、將eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。

6、用微量離心機4℃下12000g離心10分鐘。

7、用無菌牙簽從eppendorf管中去除細菌碎片。

8、取20ml進行電泳檢查。

注意:

1. 對大腸桿菌可從固體培養基上挑取單個菌落直接進行煮沸法提取質粒DNA。

2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,濃度高時,細菌裂解效果反而不好。有時不同溶菌酶也能溶菌。

3. 提取的質粒DNA中會含有RNA,但RNA并不干擾進一步實驗,如限制性內切酶消化,亞克隆及連接反應等。


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